Laporan
Genetika Molekular
Nama : Rizky Cahya Windari Tanggal Praktikum : 26 februari
2013
NRP : G34100040 Asisten : Andi Trisnandi G34090046
Kelompok : 2 Munjiati G34090011
Lab
: 4 Diah Apri G34090070
Isolasi Plasmid dan Elektroforesis
Pendahuluan
Plasmid adalah
molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromosom. Plasmid
ditemukan didalam bakteri dan ragi yang merupakan eukariota uniseluler
(Campbell 2002). Plasmid ini digunakan sebagai vektor untuk menyambung dan
mengklonkan gen didalam sel hidup. Selain plasmid, vektor yang sering digunakan
adalah kosmid dan bakteriofag ( Rakhman 2012). Kosmid merupakan modifikasi
plasmid pembawa copy sekuen DNA (cos sequence) diperlukan untuk pengepakan DNA
kedalam bakteriofage λ ( Wahyudi 2001). DNA
rekombinan pembawa kopi yang lengkap dari vektor kosmid akan bereplikasi
didalam sel seperti hal nya plsamid dan pembawa sifat resistensi terhadap
antibiotik yang dibawa oleh kosmid tersebut. Dengan demikian bakteri yang
membawa kosmid rekombinan dapat diseleksi dengan menggunakan media yang
mengandung antibiotik yang sesuai. Bakteriofag
adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang
bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor
kloning pada sel inang bakteri (Seidman 2006).
Elektroforesis
adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya,
dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik dapat digunakan dengan memanfaatkan
muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Teknik elektroforesis
dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA maupun protein (Yuwono 2008). Prinsip
kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif
pada kutub negatif serta komponen bermuatan negatif pada kutub positif. Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul.
Gel yang
digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam: 1. Gel poliakrilamida denaturasi,
berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer. 2.
Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran
besar. 3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan
sistem elektroforesis RNA pada ukuran standar (Martin 1996).
Dalam elektroforesis
ini menggunakan larutan buffer yaitu tris-asetat-EDTA (TAE). Larutan buffer ini
berfungsi untuk membuat gel. Buffer ini memiliki
kekuatan ion rendah dan kapasitas buffer yang rendah. Hal ini paling cocok untuk
elektroforesis dari potongan besar (> 20 kb) dari DNA. Cara untuk membuat
larutan penyangga TAE 50x adalah menyiapkan Tris-HCl dengan pH 8,3 2M, Asam
Asetat pekat 0,99M dan EDTA 50mM. Bahan0bahan tersebut dimasukkan kedalam air
destilata (air steril) 100ml lalu autoklaf dan simpan didalam freezer pada suhu
-20oC.
Terdapat dua macam
elektroforesis, yaitu eletroforesis vetikal dan elektroforesis horizontal.
Elektroforesis vertikal yaitu Poliakrilamida (PAA), digunakan untuk analisis
protein. Sedang elektroforesis horizontal menggunakan gel agarosa.
Elektroforesis ini digunakan untuk analisis DNA. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena
mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana,
relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan
yang lebih.
Tujuan
Percobaan
Isolasi Plasmid bertujuan untuk mengetahui dan dapat mengisolasi plasmid untuk
vektor kloning. Dan percobaan Elektroforesis pada gel agarosa bertujuan untuk
mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarosa
Metode
Isolasi plasmid
Kultur
PGEMT dan SG α
↓
1.5 ml
↓
Sentifuse
(10.000rpm) 5’
↓
Ambil pelet
↓
+250μl larutan A
↓
Vortex
↓
+ 250μl larutan B
↓
Bolak balik 10x
↓
+ 250μl
larutan C
↓
Bolak balik l0x
↓
Sentrifuse
10.000rpm 10’ 4oC
↓
Ambil
supernatan (±600μl)
↓
+ 1x vol larutan PCI
↓
Vortex
↓
Sentrifuse
10.000 rpm 10’
↓
Ambil
supernatan ±500μl
↓
+
2x vol EtOH 100%
+
0,1 x Vol NaOAc
↓
Inkubasi
30’-1jam di frezeer
↓
Sentrifuse
10.000rpm 20’ 4oC
↓
Ambil
pelet & +EtOH 70%
↓
Sentrifuse
10.000rpm 5’
↓
Keringkan pelet di oven 65oC simpan di freezer
↓
↑
+ddH2O
20-50μl
inkubasi 37oC
↓
+RNAse 0,2xVol
Pembuatan gel agarosa
0,3 gr Agarosa
↓
+ 30 ml TAE 1x
↓
Masukkan kedalam microwave
↓
Tunggu hangat kuku
↓
Tuang ke cetakan
Elektroforesis
Tuangkan larutan penyangga
↓
Ambil sisir secara pelahan
↓
Tambahkan EtBr untuk
mewarnai DNA
↓
Tambahkan pewarna
bromofenol biru
↓
Masukkan DNA kedalam sumur
↓
Tutup elektroforesis
bagian atas
↓
Hubungkan dengan power
supply
Hasil Pengamatan
Keterangan : (kiri-kanan) sumur 1 3μl, sumur 2 5μl, sumur 3 kontrol, sumur 4-13 kelompok 1-10
Pembahasan
Dalam percobaan isolasi
plasmid ini, selama prosesnya menggunakan beberapa larutan yang mempunyai peran
didalamnya. Larutan A berfungsi untuk resuspensi, larutan B berfungsi untuk
lisis dan larutan C berfungsi untuk netralisasi. PCI (phenol chloroform
isoamil) berfungsi untuk pencucian dan mendegradasi protein serta memisahkan
DNA dengan komponen lainnya (Muladno 2002). Larutan EtOH 70% berfungsi untuk
membersihkan sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya
sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni sekaligus sebagai pengikat air.
Dari percobaan yang telah
dilakukan, diperoleh hasil bahwa elektroforesis yang berhasil dilakukan adalah
sumur 1, sumur 2 dan sumur 3. Terlihat bahwa pita DNA tebal daripada sumur 4
hingga sumur 10 dan ketebalan pitanya nampak jelas. Ketebalan pita tersebut
berhubungan dengan kuantitas DNA. Jika makin tebal pita DNA maka makin banyak
DNAnya. Itu berarti dengan metode yang telah dilakukan kerja praktikan semakin
efektif.
Agarosa merupakan suatu
fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit mengandung
sulfat. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA
menurut muatan, ukuran dan bentuk. Gel agarose sendiri berfungsi untuk
memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb. Konsentrasi agarose mempengaruhi
hasil elektroforesis, karena semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar
molekul pada gel agarose lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul
yang melewatinya. Power agarose lebih rendah. Medan gerak biasanya horisontal
dan mempunyai laju pemisahan lebih cepat (Haryana 1989) sehingga tepat digunakan pada percobaan ini
Plasmid pGEM-T Easy merupakan
plasmid sirkular terbuka, memiliki dua buah origin of replication dan gen
ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung multy cloning
site. Karena memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka
plasmid (Toverhang), plasmid ini sering dipakai sebagai vektor untuk
produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan
tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga
termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen
insert dalam suatu inang. Selain itu, pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran
kecil yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat
membawa DNA target cukup banyak dan memudahkan preparasi DNA sisipan dalam
jumlah besar. Vektor berukuran kecil lebih mudah dimasukkan ke dalam sel inang
dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung tidak rapuh dibandingkan dengan
vektor berukuran besar. Selain itu plasmid dH5-alpha adalah plasmid dengan DNA
yang resisten terhadap ampisilin (Daudi 2009).
Kesimpulan
Elektroforesis dengan gel agarosa
merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi
dan purifikasi dari fragmen DNA. Pita DNA yang dihasilkan menunjukkan kuantitas
DNA.
Daftar
pustaka
Campbell
NA. 2002. Biologi Jilid 1.
Jakarta: Erlangga.
Daudi, A. 1999. pGEM-T Easy Vector Sistem dari Promega.
Departemen Ilmu Biologi, Royal Holloway University of London
Haryana. 1989. Petunjuk
Laboratorium Rekayasa Genetika. UGM Press. Yogyakarta
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher,
Oxford: xvi + 175 hlm.
Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika.
Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.
Rakhman Amalia. 2012. APLIKASI TEKNOLOGI
TRANSFORMASI DNA BAKTERI Agrobacterium tumefaciens GALUR CP4 PADA TANAMAN KEDELAI UPAYA PENINGKATAN KULTIVAR RESISTEN
TERHADAP HERBISIDA. Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas
Muhammadiyah Malang
Seidman JG. 1996. Construction of recombinant DNA Library. Current Protocol in
Molecular Biology. Vol 1. New York: J Wiley. Hlm. 5.0.3-5.11.2
SARGENT, J. R. dan S. G.
GEORGE 1975. Methods in Zone Electrophoresis BDH Chemical LTD. Poole England:
219 pp.
Wahyudi Tri Aris. 2001. ULASAN Perpustakaan Gen: Bagaimana
Mengkonstruksinya?. Jurusan Biologi FMIPA. Vol 8 No 1 Institut Pertanian
Bogor. Hlm 27-30.
Yuwono Tribowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga
