Laporan
Genetika Molekular
Nama : Rizky Cahya Windari Tanggal Praktikum : 16 April 2013
NRP : G34100040 Asisten : Andi Trisnandi G34090046
Kelompok : 2 Munjiati G34090011
Lab
: 4 Diah Apri
G34090070
Ligasi dan
Transformasi Bakteri
Pendahuluan
Ligasi merupakan
proses memasukan sekuen DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA
genom. DNA rekombinan adalah produk yang dihasilkan oleh ligasi. Dalam proses
ligasi diperlukan enzim yang berfungsi sebagai perekat untuk menggabungkan dua
molekul DNA. Ada dua enzim yang biasa digunakan yaitu 1) enzim yang dihasilkan
oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 yang disebut dengan T4
DNA ligase, 2) enzim yang dihasilkan oleh E. coli sendiri yang disebut
dengan E. coli DNA ligase. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi yang
sama yaitu mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan
nukleotida di sebelahnya. DNA ligase dapat dibedakan berdasarkan kofaktor. Kofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP,
sedangkan untuk E. coli DNA ligase adalah NAD+
(Pasternak&Bernard 2003).
Dalam konteks
genetika bakteri, Transformasi merupakan perubahan suatu genotipe sel bakteri
dengan cara mengambil DNA asing telanjang dari lingkungan sekitarnya (Campbell
2002). Prinsip dari transformasi adalah
dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang
telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran
dalam dinding dan membran sel (Lodishet al 2000). Dalam praktikum ini
enzim yang digunakan adalah T4 DNA Ligase dan menggunakan bakteri E.coli.
Tujuan
Praktikum
ligasi bertujuan untuk melakukan penyambungan dua fragmen DNA dan praktikum Transformasi Bakteri bertujuan
untuk mengetahui cara introduksi DNA ke E.coli
Metode
Ligasi
Campuran :
Vektor 1μl
Insert 1μl
T4 Ligase 0,4μl
Buffer 1μl
ddH2O 6,6μl
+
10 μl
Pembuatan Sel Kompeten
Transformasi
Hasil
Pengamatan
Gambar 1. Hasil kontrol negatif Gambar 2. Hasil
Kontrol positif
Gambar 3.
Hasil kelompok pengerjaan
bukan di laminar
keterangan :
Gambar 1. Foto kontrol negatif
berhasil sebab bakteri tidak tumbuh
Gambar 2. Foto kontrol positif berhasil sebab
tumbuh koloni bakteri
Pembahasan
Media
yang digunakan untuk mengisolasi koloni bakteri E.coli dalam proses transformasi adalah Media LB. Media LB adalah
media Luria Bertani yang mengandung 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g
NaCl dalam 1000 ml H2O, ditambahkan antibiotik rifampicin (50 μμg/ml) pH
7,1-7,2 (Mangunwardoyo 2002). Bakteri transforman
dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik ampisilin. Adanya X-gal dan
IPTG dalam media LB padat akan menghasilkan koloni bakteri yang berwarna biru
dan putih. Hanya koloni berwarna putih yang diisolasi karena di dalamnya
mengandung plasmid rekombinan (Suharsono
et all 2010).
Berdasarkan hasil
pengamatan, pada gambar 1 yaitu foto kontrol negatif menunjukkan keberhasilan.
Sebab pada media tidak tumbuh bakteri. Tidak tumbuhnya bakteri tersebut
bmenunjukkan bahwa media yang digunakan dapat mematikan bakteri tipe liar yang
tidak mengandung gen penyeleksi. Pada gambar 2 yaitu foto kontrol positif juga
menunjukkan keberhasilan sebab terdapat koloni bakteri yang tumbuh di media. Tumbuhnya
bakteri tersebut menunujukkan bahwa bakteri kompeten masih bisa hidup di media
yang tidak mengandung agen seleksi. Bakteri yang tumbuh berupa koloni yang
berwarna putih dan menyebar di sekitar cawan. Pada gambar 3 yaitu foto cawan
yang dalam pengerjaannya tidak dilakukan di dalam laminar, menunujukkan
ketidakberhasilan. Sebab tidak terbentuknya koloni berwarna putih. pada
perlakuan ini hanya kelompok 6 yang berhasil sebab terdapat koloni berwarna
putih pada media.
Ada bebrapa larutan yang
digunakan dalam proses ligasi dan transformasi bakteri. Pada proses ligasi
campuran bahannya adalah Vektor merupakan bahan yang kita sisipkan, Innert
merupakan bahan yang kita sisipi dan ukurannya lebih kecil daripada ukuran
vektor. Buffer digunakan untuk.......... ddH2O digunakan untuk.......... dalam
proses transformasi, larutan CaCl2 berfungsi untuk membuat konsentrasi yang ada
diluar bakteri agar menjadi masuk kedalam bakteri sehingga DNA dapat ikut masuk
kedalam bakteri. KCI berfungsi untuk.... MnCl berfungsi untuk... dan KOH
berfungsi untuk mengatur pH menjadi 6,7.
Ligasi dan PCR dapat
diaplikasikan dalam kehidupan sehari-sehari. Ligasi dapat digunakan untuk
mengkloning gen dan merupakan salah satu prosedur yang akan digunakan untuk
transformasi DNA. PCR dapat diaplikasikan untuk identifikasi Bakteri Hewan,
Isolasi Gen,DNA sequencing, Forensik, Diagnosa Penyakit, untuk identifikasi
Virus yang menyerang manusia dan hewan antara lain : Virus Eipstein-Barr dan
virus acquire imunodeficiency syndromes (AIDS), virus bovine leukosis, virus
penyakit kuku dan mulut. Virus ILT, virus kolera pada babi dan virus rabies
(Saefulloh&Darminto 1999)
Kesimpulan
Percobaan ligasi
pada fragmen DNA berhasil dilakukan sebab ditandai dengan terbentuknya koloni
putih pada proses transformasi dan diartikan mengandung plasmid rekombinan. Kontrol
positif dan kontrol negatif digunakan sebagai indikator dari transformasi
bakteri yang dapat menunjukkan terbentuk/tidaknya koloni.
Daftar pustaka
Campbell et all. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta : Erlangga
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular
Cell Biology. New York: Wh Freeman Company
Mangunwardoyo Wibowo. 2002. Transformasi Fragmen DNA
Kromosom Xanthomonas campestris ke dalam Escherchia
coli. Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Universitas Indonesia. Vol 6 : hal 22. Makara Sains. Jakarta, Indonesia.
Pasternak JJ, Bernard RG. 2003. Molecular
Biotechnology: Principle and Appplication of Recombinant DNA. Washington
DC: ASM Press
Saefulloh
Muharam, Darminto. 1999. Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Dalam Dalam
Diagnosis Penyakit Malignant Catarrhal
Fever (MCF) di Indonesia. Balai Penelitian Veteriner. Vol 8 : 2. Wartazoa.
Bogor,Indonesia.
Suharsono
et all. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi
H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Institut
Pertanian Bogor. Vol 1 : 67-74. J Agron. Bogor, Indonesia.