Ligasi dan Transformasi Bakteri

Laporan Genetika Molekular

Nama        : Rizky Cahya Windari                                           Tanggal Praktikum       : 16 April 2013

NRP          : G34100040                                                          Asisten : Andi Trisnandi   G34090046

Kelompok : 2                                                                                          Munjiati              G34090011

Lab            : 4                                                                                          Diah Apri            G34090070

 

Ligasi dan Transformasi Bakteri

Pendahuluan

Ligasi merupakan proses memasukan sekuen DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom. DNA rekombinan adalah produk yang dihasilkan oleh ligasi. Dalam proses ligasi diperlukan enzim yang berfungsi sebagai perekat untuk menggabungkan dua molekul DNA. Ada dua enzim yang biasa digunakan yaitu 1) enzim yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 yang disebut dengan T4 DNA ligase, 2) enzim yang dihasilkan oleh E. coli sendiri yang disebut dengan E. coli DNA ligase. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi yang sama yaitu mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan nukleotida di sebelahnya. DNA ligase dapat dibedakan berdasarkan kofaktor.  Kofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP, sedangkan untuk E. coli DNA ligase adalah NAD⁺ (Pasternak&Bernard 2003).

Dalam konteks genetika bakteri, Transformasi merupakan perubahan suatu genotipe sel bakteri dengan cara mengambil DNA asing telanjang dari lingkungan sekitarnya (Campbell 2002).  Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Lodishet al 2000). Dalam praktikum ini enzim yang digunakan adalah T4 DNA Ligase dan menggunakan bakteri E.coli.

Tujuan

Praktikum ligasi bertujuan untuk melakukan penyambungan dua fragmen DNA dan  praktikum Transformasi Bakteri bertujuan untuk mengetahui cara introduksi DNA ke E.coli

Metode

Ligasi

Campuran :

Vektor             1μl                                            

Insert               1μl

T4 Ligase        0,4μl

Buffer             1μl

ddH₂O                        6,6μl      +

                        10 μl

 

Pembuatan Sel Kompeten

                        koloni

                                                              TFB 500ml

                                                                                                 

 

Transformasi

 

Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil kontrol negatif                                Gambar 2. Hasil Kontrol positif

                                      Gambar 3. Hasil kelompok pengerjaan

                                                       bukan di laminar

keterangan :

Gambar 1. Foto kontrol negatif  berhasil sebab bakteri tidak tumbuh
Gambar 2. Foto kontrol positif berhasil sebab tumbuh koloni bakteri

Pembahasan

Media yang digunakan untuk mengisolasi koloni bakteri E.coli dalam proses transformasi adalah Media LB. Media LB adalah media Luria Bertani yang mengandung 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g NaCl dalam 1000 ml H2O, ditambahkan antibiotik rifampicin (50 μμg/ml) pH 7,1-7,2 (Mangunwardoyo 2002). Bakteri transforman dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik ampisilin. Adanya X-gal dan IPTG dalam media LB padat akan menghasilkan koloni bakteri yang berwarna biru dan putih. Hanya koloni berwarna putih yang diisolasi karena di dalamnya mengandung plasmid rekombinan (Suharsono  et all 2010).

Berdasarkan hasil pengamatan, pada gambar 1 yaitu foto kontrol negatif menunjukkan keberhasilan. Sebab pada media tidak tumbuh bakteri. Tidak tumbuhnya bakteri tersebut bmenunjukkan bahwa media yang digunakan dapat mematikan bakteri tipe liar yang tidak mengandung gen penyeleksi. Pada gambar 2 yaitu foto kontrol positif juga menunjukkan keberhasilan sebab terdapat koloni bakteri yang tumbuh di media. Tumbuhnya bakteri tersebut menunujukkan bahwa bakteri kompeten masih bisa hidup di media yang tidak mengandung agen seleksi. Bakteri yang tumbuh berupa koloni yang berwarna putih dan menyebar di sekitar cawan. Pada gambar 3 yaitu foto cawan yang dalam pengerjaannya tidak dilakukan di dalam laminar, menunujukkan ketidakberhasilan. Sebab tidak terbentuknya koloni berwarna putih. pada perlakuan ini hanya kelompok 6 yang berhasil sebab terdapat koloni berwarna putih pada media.

Ada bebrapa larutan yang digunakan dalam proses ligasi dan transformasi bakteri. Pada proses ligasi campuran bahannya adalah Vektor merupakan bahan yang kita sisipkan, Innert merupakan bahan yang kita sisipi dan ukurannya lebih kecil daripada ukuran vektor. Buffer digunakan untuk.......... ddH2O digunakan untuk.......... dalam proses transformasi, larutan CaCl2 berfungsi untuk membuat konsentrasi yang ada diluar bakteri agar menjadi masuk kedalam bakteri sehingga DNA dapat ikut masuk kedalam bakteri. KCI berfungsi untuk.... MnCl berfungsi untuk... dan KOH berfungsi untuk mengatur pH menjadi 6,7.

Ligasi dan PCR dapat diaplikasikan dalam kehidupan sehari-sehari. Ligasi dapat digunakan untuk mengkloning gen dan merupakan salah satu prosedur yang akan digunakan untuk transformasi DNA. PCR dapat diaplikasikan untuk identifikasi Bakteri Hewan, Isolasi Gen,DNA sequencing, Forensik, Diagnosa Penyakit, untuk identifikasi Virus yang menyerang manusia dan hewan antara lain : Virus Eipstein-Barr dan virus acquire imunodeficiency syndromes (AIDS), virus bovine leukosis, virus penyakit kuku dan mulut. Virus ILT, virus kolera pada babi dan virus rabies (Saefulloh&Darminto 1999)

Kesimpulan

Percobaan ligasi pada fragmen DNA berhasil dilakukan sebab ditandai dengan terbentuknya koloni putih pada proses transformasi dan diartikan mengandung plasmid rekombinan. Kontrol positif dan kontrol negatif digunakan sebagai indikator dari transformasi bakteri yang dapat menunjukkan terbentuk/tidaknya koloni.

Daftar pustaka

Campbell et all. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular Cell Biology. New York: Wh Freeman Company

Mangunwardoyo Wibowo. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas campestris ke dalam Escherchia coli. Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Vol 6 : hal 22. Makara Sains. Jakarta, Indonesia.

Pasternak JJ, Bernard RG. 2003. Molecular Biotechnology: Principle and Appplication of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press

Saefulloh Muharam, Darminto. 1999. Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Dalam Dalam Diagnosis Penyakit Malignant Catarrhal Fever (MCF) di Indonesia. Balai Penelitian Veteriner. Vol 8 : 2. Wartazoa. Bogor,Indonesia.

Suharsono et all. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Institut Pertanian Bogor. Vol 1 : 67-74. J Agron. Bogor, Indonesia.