"heart" sock

bahagia ketika ku mengenalmu

bahagia ketika ku melihat wajah itu

bahagia ketika canda tawa selalu hadir

saat itu................

waktu seiring berjalan..

semakin mengenalmu, ku tahu bahwa ini namanya cinta

tak mudah memang untuk melangkah

terkadang disaat melangkah ku menginjak duri

tersandung batu

diterpa angin kencang

panas terik yg begitu menyengat

membuatku seakan dehidrasi

tercekik seperti tak bisa bernafas

tapi

ku nikmati

seakan aku berjalan di sebuah taman indah

penuh bunga bermekaran

angin sepoi-sepoi 

berjalan diatas padang rumput nan hijau

terhipnotis? mgkn bisa ku bilang "iya"

aku tau ini sakit

seluruh saraf neuron ini mengisyaratkan bahwa aku sudah lelah

menghantarkan respon dari sebuah stimulus bahwa ini sungguh menyakitkan

seluruh aliran darah ini seakan telah menyatu kepada sebuah logika yg sesungguhnya aku sadari semua ini

tp seolah-olah efektor tubuh ku tetap berdiri disini mengalahkan segala insting yang kurasa tak salah

hahaha

bodoh

iya.. how stupid i am

membekukan seluruh saraf ini

mematikan seluruh logika ini

ntahlah..

Ligasi dan Transformasi Bakteri

Laporan Genetika Molekular

Nama        : Rizky Cahya Windari                                           Tanggal Praktikum       : 16 April 2013

NRP          : G34100040                                                          Asisten : Andi Trisnandi   G34090046

Kelompok : 2                                                                                          Munjiati              G34090011

Lab            : 4                                                                                          Diah Apri            G34090070

 

Ligasi dan Transformasi Bakteri

Pendahuluan

Ligasi merupakan proses memasukan sekuen DNA yang mengandung gen yang diinginkan ke dalam DNA genom. DNA rekombinan adalah produk yang dihasilkan oleh ligasi. Dalam proses ligasi diperlukan enzim yang berfungsi sebagai perekat untuk menggabungkan dua molekul DNA. Ada dua enzim yang biasa digunakan yaitu 1) enzim yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terinfeksi virus T4 yang disebut dengan T4 DNA ligase, 2) enzim yang dihasilkan oleh E. coli sendiri yang disebut dengan E. coli DNA ligase. Kedua enzim tersebut mempunyai fungsi yang sama yaitu mensintesis pembentukan ikatan fosfodiester yang menghubungkan nukleotida di sebelahnya. DNA ligase dapat dibedakan berdasarkan kofaktor.  Kofaktor untuk T4 DNA ligase adalah ATP, sedangkan untuk E. coli DNA ligase adalah NAD⁺ (Pasternak&Bernard 2003).

Dalam konteks genetika bakteri, Transformasi merupakan perubahan suatu genotipe sel bakteri dengan cara mengambil DNA asing telanjang dari lingkungan sekitarnya (Campbell 2002).  Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel (Lodishet al 2000). Dalam praktikum ini enzim yang digunakan adalah T4 DNA Ligase dan menggunakan bakteri E.coli.

Tujuan

Praktikum ligasi bertujuan untuk melakukan penyambungan dua fragmen DNA dan  praktikum Transformasi Bakteri bertujuan untuk mengetahui cara introduksi DNA ke E.coli

Metode

Ligasi

Campuran :

Vektor             1μl                                            

Insert               1μl

T4 Ligase        0,4μl

Buffer             1μl

ddH₂O                        6,6μl      +

                        10 μl

 

Pembuatan Sel Kompeten

                        koloni

                                                              TFB 500ml

                                                                                                 

 

Transformasi

 

Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil kontrol negatif                                Gambar 2. Hasil Kontrol positif

                                      Gambar 3. Hasil kelompok pengerjaan

                                                       bukan di laminar

keterangan :

Gambar 1. Foto kontrol negatif  berhasil sebab bakteri tidak tumbuh
Gambar 2. Foto kontrol positif berhasil sebab tumbuh koloni bakteri

Pembahasan

Media yang digunakan untuk mengisolasi koloni bakteri E.coli dalam proses transformasi adalah Media LB. Media LB adalah media Luria Bertani yang mengandung 10 g tripton, 5 g yeast ekstrak, dan 10 g NaCl dalam 1000 ml H2O, ditambahkan antibiotik rifampicin (50 μμg/ml) pH 7,1-7,2 (Mangunwardoyo 2002). Bakteri transforman dapat hidup pada media yang mengandung antibiotik ampisilin. Adanya X-gal dan IPTG dalam media LB padat akan menghasilkan koloni bakteri yang berwarna biru dan putih. Hanya koloni berwarna putih yang diisolasi karena di dalamnya mengandung plasmid rekombinan (Suharsono  et all 2010).

Berdasarkan hasil pengamatan, pada gambar 1 yaitu foto kontrol negatif menunjukkan keberhasilan. Sebab pada media tidak tumbuh bakteri. Tidak tumbuhnya bakteri tersebut bmenunjukkan bahwa media yang digunakan dapat mematikan bakteri tipe liar yang tidak mengandung gen penyeleksi. Pada gambar 2 yaitu foto kontrol positif juga menunjukkan keberhasilan sebab terdapat koloni bakteri yang tumbuh di media. Tumbuhnya bakteri tersebut menunujukkan bahwa bakteri kompeten masih bisa hidup di media yang tidak mengandung agen seleksi. Bakteri yang tumbuh berupa koloni yang berwarna putih dan menyebar di sekitar cawan. Pada gambar 3 yaitu foto cawan yang dalam pengerjaannya tidak dilakukan di dalam laminar, menunujukkan ketidakberhasilan. Sebab tidak terbentuknya koloni berwarna putih. pada perlakuan ini hanya kelompok 6 yang berhasil sebab terdapat koloni berwarna putih pada media.

Ada bebrapa larutan yang digunakan dalam proses ligasi dan transformasi bakteri. Pada proses ligasi campuran bahannya adalah Vektor merupakan bahan yang kita sisipkan, Innert merupakan bahan yang kita sisipi dan ukurannya lebih kecil daripada ukuran vektor. Buffer digunakan untuk.......... ddH2O digunakan untuk.......... dalam proses transformasi, larutan CaCl2 berfungsi untuk membuat konsentrasi yang ada diluar bakteri agar menjadi masuk kedalam bakteri sehingga DNA dapat ikut masuk kedalam bakteri. KCI berfungsi untuk.... MnCl berfungsi untuk... dan KOH berfungsi untuk mengatur pH menjadi 6,7.

Ligasi dan PCR dapat diaplikasikan dalam kehidupan sehari-sehari. Ligasi dapat digunakan untuk mengkloning gen dan merupakan salah satu prosedur yang akan digunakan untuk transformasi DNA. PCR dapat diaplikasikan untuk identifikasi Bakteri Hewan, Isolasi Gen,DNA sequencing, Forensik, Diagnosa Penyakit, untuk identifikasi Virus yang menyerang manusia dan hewan antara lain : Virus Eipstein-Barr dan virus acquire imunodeficiency syndromes (AIDS), virus bovine leukosis, virus penyakit kuku dan mulut. Virus ILT, virus kolera pada babi dan virus rabies (Saefulloh&Darminto 1999)

Kesimpulan

Percobaan ligasi pada fragmen DNA berhasil dilakukan sebab ditandai dengan terbentuknya koloni putih pada proses transformasi dan diartikan mengandung plasmid rekombinan. Kontrol positif dan kontrol negatif digunakan sebagai indikator dari transformasi bakteri yang dapat menunjukkan terbentuk/tidaknya koloni.

Daftar pustaka

Campbell et all. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta : Erlangga

Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular Cell Biology. New York: Wh Freeman Company

Mangunwardoyo Wibowo. 2002. Transformasi Fragmen DNA Kromosom Xanthomonas campestris ke dalam Escherchia coli. Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Vol 6 : hal 22. Makara Sains. Jakarta, Indonesia.

Pasternak JJ, Bernard RG. 2003. Molecular Biotechnology: Principle and Appplication of Recombinant DNA. Washington DC: ASM Press

Saefulloh Muharam, Darminto. 1999. Aplikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) Dalam Dalam Diagnosis Penyakit Malignant Catarrhal Fever (MCF) di Indonesia. Balai Penelitian Veteriner. Vol 8 : 2. Wartazoa. Bogor,Indonesia.

Suharsono et all. 2010. Isolasi dan Pengklonan Fragmen cDNA Gen Penyandi H+-ATPase Membran Plasma dari Melastoma malabathricum L. Institut Pertanian Bogor. Vol 1 : 67-74. J Agron. Bogor, Indonesia.

isolasi Plasmid dan elektroforesis

Laporan Genetika Molekular

Nama        : Rizky Cahya Windari                                           Tanggal Praktikum : 26 februari 2013

NRP          : G34100040                                                          Asisten : Andi Trisnandi  G34090046

Kelompok : 2                                                                                          Munjiati             G34090011

Lab            : 4                                                                                          Diah Apri           G34090070

 

Isolasi Plasmid dan Elektroforesis

Pendahuluan

Plasmid adalah molekul DNA sirkular berukuran kecil yang terpisah dari kromosom. Plasmid ditemukan didalam bakteri dan ragi yang merupakan eukariota uniseluler (Campbell 2002). Plasmid ini digunakan sebagai vektor untuk menyambung dan mengklonkan gen didalam sel hidup. Selain plasmid, vektor yang sering digunakan adalah kosmid dan bakteriofag ( Rakhman 2012). Kosmid merupakan modifikasi plasmid pembawa copy sekuen DNA (cos sequence) diperlukan untuk pengepakan DNA kedalam bakteriofage λ ( Wahyudi 2001). DNA rekombinan pembawa kopi yang lengkap dari vektor kosmid akan bereplikasi didalam sel seperti hal nya plsamid dan pembawa sifat resistensi terhadap antibiotik yang dibawa oleh kosmid tersebut. Dengan demikian bakteri yang membawa kosmid rekombinan dapat diseleksi dengan menggunakan media yang mengandung antibiotik yang sesuai. Bakteriofag adalah virus yang sel inangnya berupa bakteri. Dengan daur hidupnya yang bersifat litik atau lisogenik bakteriofag dapat digunakan sebagai vektor kloning pada sel inang bakteri (Seidman 2006).

Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA  yang bermuatan negatif. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA maupun protein (Yuwono 2008). Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif pada kutub negatif serta komponen bermuatan negatif pada kutub positif. Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul.

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam: 1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan menganalisis pemanjangan primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis RNA pada ukuran standar (Martin 1996).

Dalam elektroforesis ini menggunakan larutan buffer yaitu tris-asetat-EDTA (TAE). Larutan buffer ini berfungsi untuk membuat gel. Buffer ini memiliki kekuatan ion rendah dan kapasitas buffer yang rendah. Hal ini paling cocok untuk elektroforesis dari potongan besar (> 20 kb) dari DNA. Cara untuk membuat larutan penyangga TAE 50x adalah menyiapkan Tris-HCl dengan pH 8,3 2M, Asam Asetat pekat 0,99M dan EDTA 50mM. Bahan0bahan tersebut dimasukkan kedalam air destilata (air steril) 100ml lalu autoklaf dan simpan didalam freezer pada suhu -20^oC.

Terdapat dua macam elektroforesis, yaitu eletroforesis vetikal dan elektroforesis horizontal. Elektroforesis vertikal yaitu Poliakrilamida (PAA), digunakan untuk analisis protein. Sedang elektroforesis horizontal menggunakan gel agarosa. Elektroforesis ini digunakan untuk analisis DNA. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih.

Tujuan

Percobaan Isolasi Plasmid bertujuan untuk mengetahui dan dapat mengisolasi plasmid untuk vektor kloning. Dan percobaan Elektroforesis pada gel agarosa bertujuan untuk mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarosa

Metode

Isolasi plasmid

Kultur PGEMT dan SG α

                   ↓

              1.5 ml

                   ↓

Sentifuse (10.000rpm) 5’

                   ↓

          Ambil pelet

                  ↓

     +250μl larutan A

                 ↓

            Vortex

                 ↓

      + 250μl larutan B

                 ↓

       Bolak balik 10x

                 ↓

      + 250μl  larutan C

                 ↓

       Bolak balik l0x

                 ↓

Sentrifuse 10.000rpm 10’ 4^oC

                 ↓

Ambil supernatan (±600μl)

                 ↓

    + 1x vol larutan PCI

                 ↓

            Vortex

                 ↓

Sentrifuse 10.000 rpm 10’

                 ↓

Ambil supernatan ±500μl

                 ↓

+ 2x vol EtOH 100%

+ 0,1 x Vol NaOAc

                 ↓

Inkubasi 30’-1jam di frezeer

                 ↓

Sentrifuse 10.000rpm 20’ 4^oC

                 ↓

Ambil pelet & +EtOH 70%

                 ↓

Sentrifuse 10.000rpm 5’

                 ↓

Keringkan pelet di oven 65^oC                                           simpan di freezer

                 ↓                                                                                    ↑

+ddH₂O 20-50μl                                                                  inkubasi 37^oC

                ↓

+RNAse 0,2xVol

Pembuatan gel agarosa

0,3 gr Agarosa

         ↓

+ 30 ml TAE 1x

         ↓

Masukkan kedalam microwave

        ↓

Tunggu hangat kuku

        ↓

Tuang ke cetakan

Elektroforesis

Tuangkan larutan penyangga

                 ↓

Ambil sisir secara pelahan

                 ↓

Tambahkan EtBr untuk mewarnai DNA

                 ↓

Tambahkan pewarna bromofenol biru

                 ↓

Masukkan DNA kedalam sumur

                 ↓

Tutup elektroforesis bagian atas

                 ↓

Hubungkan dengan power supply

Hasil Pengamatan

Keterangan : (kiri-kanan) sumur 1 3μl, sumur 2 5μl,  sumur 3 kontrol, sumur 4-13 kelompok 1-10

Pembahasan

Dalam percobaan isolasi plasmid ini, selama prosesnya menggunakan beberapa larutan yang mempunyai peran didalamnya. Larutan A berfungsi untuk resuspensi, larutan B berfungsi untuk lisis dan larutan C berfungsi untuk netralisasi. PCI (phenol chloroform isoamil) berfungsi untuk pencucian dan mendegradasi protein serta memisahkan DNA dengan komponen lainnya (Muladno 2002). Larutan EtOH 70% berfungsi untuk membersihkan sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya sehingga dapat diperoleh plasmid yang murni sekaligus sebagai pengikat air.

Dari percobaan yang telah dilakukan, diperoleh hasil bahwa elektroforesis yang berhasil dilakukan adalah sumur 1, sumur 2 dan sumur 3. Terlihat bahwa pita DNA tebal daripada sumur 4 hingga sumur 10 dan ketebalan pitanya nampak jelas. Ketebalan pita tersebut berhubungan dengan kuantitas DNA. Jika makin tebal pita DNA maka makin banyak DNAnya. Itu berarti dengan metode yang telah dilakukan kerja praktikan semakin efektif.

Agarosa merupakan suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer netral dan sedikit mengandung sulfat. Elektroforesis gel agarosa adalah metode pemisahan molekul DNA dan RNA menurut muatan, ukuran dan bentuk. Gel agarose sendiri berfungsi untuk memisahkan fragmen DNA antara 100bp – 50kb. Konsentrasi agarose mempengaruhi hasil elektroforesis, karena semakin tinggi konsentrasi maka ruang antar molekul pada gel agarose lebih kecil sehingga mempersulit pergerakan molekul yang melewatinya. Power agarose lebih rendah. Medan gerak biasanya horisontal dan mempunyai laju pemisahan lebih cepat (Haryana 1989) sehingga  tepat digunakan pada percobaan ini

Plasmid pGEM-T Easy merupakan plasmid sirkular terbuka, memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung multy cloning site. Karena memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid (Toverhang), plasmid ini sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu inang. Selain itu, pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar. Vektor berukuran kecil lebih mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar. Selain itu plasmid dH5-alpha adalah plasmid dengan DNA yang resisten terhadap ampisilin (Daudi 2009).

Kesimpulan

Elektroforesis dengan gel agarosa merupakan metode standar untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari fragmen DNA. Pita DNA yang dihasilkan menunjukkan kuantitas DNA.

Daftar pustaka

Campbell NA. 2002. Biologi Jilid 1. Jakarta: Erlangga.

Daudi, A. 1999. pGEM-T Easy Vector Sistem dari Promega. Departemen Ilmu Biologi, Royal Holloway University of London

Haryana. 1989. Petunjuk Laboratorium Rekayasa Genetika. UGM Press. Yogyakarta

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi + 175 hlm.

Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda.

Rakhman Amalia. 2012. APLIKASI TEKNOLOGI TRANSFORMASI DNA BAKTERI Agrobacterium tumefaciens GALUR CP4 PADA TANAMAN KEDELAI UPAYA PENINGKATAN KULTIVAR RESISTEN TERHADAP HERBISIDA. Program Studi Pendidikan Biologi FKIP Universitas Muhammadiyah Malang

Seidman JG. 1996. Construction of recombinant DNA Library. Current Protocol in Molecular Biology. Vol 1. New York: J Wiley. Hlm. 5.0.3-5.11.2

SARGENT, J. R. dan S. G. GEORGE 1975. Methods in Zone Electrophoresis BDH Chemical LTD. Poole England: 219 pp.

Wahyudi Tri Aris. 2001. ULASAN Perpustakaan Gen: Bagaimana Mengkonstruksinya?. Jurusan Biologi FMIPA. Vol 8 No 1 Institut Pertanian Bogor. Hlm 27-30.

Yuwono Tribowo. 2008. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga